I. 引言
FDA 于 2026 年 4 月发布的一份《Safety Assessment of Genome Editing in Human Gene Therapy Products Using Next Generation Sequencing》行业指南草案（征求意见稿）, 本指南就可能需要在非临床研究中采用的、基于下一代测序（NGS）的方法提出建议，以支持研究性人类基因组编辑（GE）产品启动临床试验。本指南的建议是在 2024 年 1 月发布的《行业指南：纳入人类基因组编辑的人类基因治疗产品》中关于非临床、临床以及化学、生产与控制（CMC）考虑事项基础上的补充。人类 GE 产品的临床开发计划应同时应对基因治疗产品本身的风险，以及由基因组编辑引入的额外风险，包括脱靶编辑和针对遗传病（包括个体化疗法）治疗中出现的非预期基因组改变。本指南中的建议可指导设计利用 NGS 方法及生物信息学分析开展的非临床研究，用于评估在人类 GE 产品中，由脱靶编辑和基因组完整性受损所带来的潜在安全风险，这些研究结果将作为研究性新药（IND）申请和生物制品许可申请（BLA）的支持材料提交。FDA 的指南文件（包括本指南）不具有法律约束力，而是反映 FDA 当前对相关主题的科学与监管观点。指南中使用“应（should）”一词表示建议或推荐，而非强制要求。
II. 背景
基因组编辑工具或编辑器被设计用于在基因组、表观基因组或转录组中的特定（即预期的靶向）位点进行编辑。不同编辑工具所采用的序列识别机制和作用机制的差异，促成了多种不同的 GE 技术模式。例如，CRISPR Cas 系统通过引导 RNA（gRNA）识别靶向基因组中具有互补序列的特定位点，在存在原间隔序列相邻基序（PAM）的条件下实现编辑。随着多种具有不同 PAM 要求和核苷酸编辑能力的 Cas 蛋白的发现，CRISPR Cas 系统已高度多样化。此外，通过将 Cas 蛋白与脱氨酶、逆转录酶或 DNA 甲基转移酶等效应分子融合，为已经不断扩展的基因编辑工具箱增添了多功能性。相比之下，Meganuclease、锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等基因组编辑模式，依赖蛋白结构域识别特定 DNA 序列来实现编辑。随着相关研究的持续开展，基因组编辑领域预计将不断出现更新、更具可编程性和更高特异性的编辑模式。基因组编辑既可用于体外编辑细胞（来自患者的自体细胞或来自健康供者的异体细胞），也可通过递送编码编辑器的 mRNA，或通过在启动子控制下表达编辑器编码序列的 DNA 载体实现体内编辑。然而，在所有这些应用场景中，脱靶编辑和/或染色体易位均构成潜在安全风险，因为此类改变可能对正常细胞功能产生不利影响。因此，对脱靶编辑风险以及对染色体完整性的影响进行充分评估，对于最大程度减少靶细胞或靶组织中的非预期改变至关重要。
III. 适用范围
本指南适用于开发涉及基因组编辑技术的人类基因治疗药物产品。按照 2024 年 1 月 GE 指南，人类 GE 是指在人体体细胞基因组中特定位点添加、删除、改变或替换 DNA 序列的过程。鉴于基因组编辑领域的快速发展，本指南所称的人类 GE 产品亦包括可修改表观基因组或切割RNA的产品。因此，本指南中关于基于 NGS 的脱靶编辑评估的建议，适用于编辑 DNA、表观基因组或切割 RNA 的所有此类产品。
IV. 下一代测序（NGS）的相关考虑
下一代测序技术及其配套的生物信息学工具，通常可通过靶向或全基因组测序方法实现对编辑结果的高灵敏度、定量化评估。申办方应根据靶向和脱靶编辑分析的目的选择适当的测序策略。例如，若评估的编辑事件仅涉及 ≤50 bp 的短 DNA 片段改变，则采用基于短读长的测序策略通常是充分的；而对于可能导致较大插入或缺失的编辑事件，则可能需要采用基于长读长的测序策略。测序应使用足量的起始材料（如基因组 DNA、细胞数目或 RNA，视具体情况而定），并达到能够检测编辑频率通常低于靶向编辑率的潜在脱靶事件所需的测序深度。申办方应通过内部数据和/或同行评审文献，以支持测序深度的充分性和灵敏度，并支持其检测低频脱靶编辑事件的策略。并在适当情况下采用减少 PCR 和/或引物偏倚的策略。NGS 研究报告中应详细描述样本信息、核酸提取及文库构建流程、测序方法、生物信息学分析步骤、分析参数和引用的参考序列与数据库，并应以表格形式提交分析结果数据。
V. 靶向（On target）编辑位点评估的相关考虑
靶向位点是指编辑器预期进行编辑的基因组或转录组中特定序列。靶向编辑率可通过对靶向位点进行测序，并计算包含预期编辑的测序读段在覆盖该位点的全部读段中的比例来确定。申办方应以比例或百分比形式报告靶向编辑率。用于靶向和脱靶评估的样本，其靶向编辑率应与拟最终药物产品中的靶向编辑率具有可比性，以确保样本中存在适当水平的编辑器活性。1. 测序策略
当编辑仅涉及单个核苷酸或短片段核苷酸改变时，可采用短读长或长读长测序方法；当编辑模式可能导致双链断裂或较大规模的插入或缺失时，则应采用长读长测序方法。申办方应论证所选测序方法在靶向位点评估中的充分性。
2. 样本选择
靶向位点评估应使用与体外 GE 产品中实际被编辑的细胞类型相同的细胞样本，或使用能够代表体内 GE 产品预期作用部位细胞类型的样本。
VI. 脱靶（Off target）编辑活性评估研究的相关考虑
对于 DNA 编辑器和表观遗传编辑器，脱靶编辑位点是指在基因组中观察到编辑活性、但并非预期被编辑的任何序列。类似地，对于 RNA 编辑器，脱靶编辑位点是指在转录组中发生的、会导致基因表达出现非预期改变的任何编辑事件。这些脱靶位点通常与拟编辑的靶向位点在序列上具有一定程度的同源性或相似性。本章就脱靶编辑位点的提名（nomination）、确认（confirmation）以及脱靶分析参数提出建议。具体包括：样本选择、使用特定于技术模式的方法或通用方法进行脱靶编辑位点提名、研究设计中应报告的关键信息，以及研究结果的报告方式。为提高脱靶编辑活性评估方法的可重复性和灵敏度，FDA 建议申办方：采用适当的 NGS 方法（见第 IV 章）；选用能够实现预期靶向编辑率的合适样本（见第 VI.A 节）；并在研究中使用生物学重复。
A. 用于脱靶编辑分析的样本
脱靶位点提名研究和确认性研究应在多个生物学重复中开展。优先建议使用来源于患者或健康供体的人类细胞。如果无法获得原代人类细胞样本，申办方可考虑使用具有代表性的人类永生化细胞系，并应结合数据提供科学依据，以支持所选样本在本研究中的充分性。
FDA 建议申办方使用能够代表其拟进行离体（ex vivo）或体内（in vivo）编辑的靶细胞类型的细胞样本。样本选择还会受到编辑方式（体内或离体）、样本可获得性以及细胞是否适用于体外培养条件等因素的影响。
1. 离体（Ex vivo）产品
针对离体 GE 产品的脱靶编辑评估研究，应使用与最终药物产品制备过程中被编辑的细胞类型完全相同的细胞。同时，用于评估脱靶风险的样本，其靶向编辑率应与最终药物产品中观察到的靶向编辑率具有可比性。
如果 GE 策略旨在纠正患者细胞中的特定突变，FDA 建议使用患者来源的细胞，或使用经工程化改造、携带该靶突变的正常细胞。这种策略有助于准确报告靶向位点的编辑率。在适当情况下，申办方亦可使用健康供体细胞，但需提供充分的科学依据以支持该方法的充分性。
若申办方选择的细胞类型不同于其拟在药物产品中编辑的细胞类型，则应提供充分的科学依据，以支持该样本选择策略在脱靶编辑评估中的充分性。
2. 体内（In vivo）产品
在评估体内产品的脱靶编辑活性时，FDA 建议申办方使用能够代表药物产品在体内预期作用靶组织的适当细胞类型，并采用可实现预期靶向编辑率的编辑参数。
如果合适的细胞类型不可获得、难以获取，或不适用于体外研究，申办方可以考虑采用替代方法或细胞样本开展脱靶编辑评估研究，但需提供科学依据。例如，可采用需要基因组 DNA 作为起始材料的生化分析方法用于脱靶位点提名。
当拟编辑事件用于纠正致病突变时，使用健康供体细胞将无法评估靶向编辑率。在这种情况下，FDA 建议使用患者来源细胞或经工程化改造、携带靶突变的正常细胞来评估脱靶编辑活性。如果由于疾病严重程度、疾病罕见性或患者样本有限等原因无法获得携带靶突变的细胞，申办方可以考虑使用健康供体样本，但必须提供科学论证。
此外，如 2024 年 1 月 GE 指南所述，生物分布研究的数据应用于判断：是否有必要在其他（非靶）组织或器官类型所代表的细胞中，进一步开展靶向位点评估、脱靶位点提名及确认性分析。
在采用基于细胞的方法评估脱靶编辑活性时，FDA 建议尽可能使用与体内药物产品相同的递送方式（例如，脂质纳米颗粒（LNP）、腺相关病毒（AAV）载体、电转染等）。如果体内递送方式不适用于体外细胞系统，申办方可考虑替代递送方法。在此类研究中，申办方应评估并报告编辑器的表达水平和靶向编辑率，并在研究报告中提交相关数据，同时提供科学依据支持其样本选择、递送方式和编辑参数的合理性。
B. 特定编辑模式的脱靶位点提名方法
2024 年 1 月 GE 指南建议综合采用多种方法进行脱靶位点提名，包括基于细胞的方法、生化方法以及计算（in silico）方法。基于细胞的方法通常利用离体编辑细胞获得的基因组 DNA 进行脱靶分析；而生化方法则使用体外编辑的纯化基因组 DNA 作为起始材料。随后，均需进行文库构建、NGS 测序及生物信息学分析（见第 IV 章）。
最初，细胞法和生化法主要用于评估会在基因组中造成 DNA 双链断裂的编辑器的脱靶活性。随着技术发展，这些方法已被改进，或开发出新的方法，以检测基因组中的单链断裂或缺口。因此，申办方在选择脱靶位点提名方法时，应充分考虑其编辑器的作用机制。例如，用于检测由双链断裂引起脱靶编辑的方法，可能不适用于仅产生单链缺口的碱基编辑器。在此类情形下，申办方可考虑采用经合理设计的方法，例如使用内切酶在单链缺口位点诱导双链断裂，从而使编辑事件能够在后续测序分析中被检测到。
申办方在选择已发表的、特定编辑模式的脱靶分析方法时，应结合其编辑器的作用机制，并通过引用相关同行评审文献和/或提供自有数据来论证其方法选择的充分性。若对已发表方法进行了重大修改，则应提供额外信息或研究证明该修改不会降低方法灵敏度、损害数据质量或引入系统性偏倚。当采用新的、尚未公开发表的脱靶分析方法时，申办方应提供额外信息以证明该方法的灵敏度和充分性。例如，对于基于 CRISPR Cas 的产品，可通过使用研究充分的 gRNA 作为参考，对比新方法与既有方法识别到的脱靶位点情况。对于非 CRISPR Cas 编辑模式，也可采用类似策略，并通过开发和应用阳性对照加以支持。每一项脱靶位点提名研究的结果均应以表格形式提交，列出所有被提名的脱靶位点（见第 VI.F 节关于报告要求的建议）。
C. 通用的脱靶位点提名方法
在尚无成熟的经验性方法（细胞法或生化法）可用于评估特定编辑模式安全性的情况下，申办方可考虑采用更具通用性的脱靶位点提名方法，包括计算算法或成熟的基于NGS的方法。
1. 基于计算（In silico）的方法
潜在脱靶编辑位点的数量和脱靶编辑风险，在很大程度上取决于 gRNA 或靶序列与人类基因组中其他区域之间的序列同源性。计算机模拟或计算方法可用于扫描参考基因组，识别与用户提供的 gRNA 或靶序列存在同源性的其他基因组区域。
对于基于 CRISPR Cas 的产品，序列同源性搜索应考虑 DNA 和 gRNA 中的错配以及凸起，并应纳入 PAM 要求或其他编辑模式特异性的序列要求。对于其他编辑模式，也可采用类似的、考虑序列变异的同源性搜索策略。
申办方应就所采用的搜索参数提供科学依据，可通过引用同行评审文献或提交内部数据来加以支持。
2. 基于 NGS 的脱靶编辑位点提名方法
现有的 NGS 技术可用于评估基因组、转录组或表观基因组的变化，或用于定量分析 mRNA 丰度。根据编辑器的作用机制，申办方可选择合适的 NGS 方法来评估脱靶编辑风险。例如，用于在特定位点甲基化胞嘧啶的表观基因组编辑器，其脱靶风险评估应采用全基因组 DNA 甲基化分析方法。
申办方在采用此类 NGS 方法时，应通过同行评审文献或内部分析来论证其实验设计和分析参数的充分性。除第 IV 章和第 V 章提出的通用建议外，FDA 还提出以下补充建议：
• 应明确测序质量和测序深度的接受标准，并提供科学依据以支持检测灵敏度、覆盖范围和重复性；
• 应详细描述用于过滤测序读段或变异的步骤，并就碱基质量或比对质量阈值提供科学论证；
• 任何用于判定脱靶编辑事件的其他分析因素，均应清楚展示并给出合理解释。
D. 确认性检测方法
申办方应采用适当的细胞类型，对提名的脱靶位点进行验证，并测定胆各脱靶位点的编辑频率。确认性检测方法可包括基于探针的序列富集、靶向扩增测序或其他等效方法。虽然 FDA 建议对所有提名的脱靶位点开展确认性检测，但申办方可在提供科学依据的前提下，仅选择部分脱靶位点进行确认，例如基于统计阈值、编辑截断值、在多样本中重复出现等标准。然而，应避免使用过于严格的筛选标准，以免错过评估低频脱靶事件的机会。确认性检测所采用的测序策略应在预先设定的测序深度和质量标准下进行，并尽量减少偏倚，以确保能够检测低频编辑事件。确认性检测应在适当的细胞类型中进行。此外，建议使用未编辑对照样本和已编辑样本的配对样本来确定靶向编辑位点和所有脱靶编辑位点的编辑率。
E. 分析参数
脱靶位点提名和确认性研究中使用的分析参数取决于具体实验设计和 NGS 方法。对于基于 CRISPR Cas 的编辑器，若其已被证实可识别多种 PAM 序列，则脱靶分析策略应纳入不同的 PAM 类型。申办方应通过文献或内部数据支持其 PAM 纳入或排除策略。无论采用无偏全基因组/外显子组/转录组/表观基因组测序，还是靶向测序方法，所有用于数据分析的过滤参数均应予以报告，并附带科学依据。
F. 脱靶编辑位点的报告
在报告提名及确认的脱靶位点时，申办方应报告相应研究中测得的读段数和/或编辑频率。同时，FDA 建议说明用于注释基因组坐标的工具。
脱靶位点的注释列表应至少包括：基因组坐标、与 gRNA 或靶序列相比的错配数及插缺信息、（适用于 CRISPR Cas 编辑器的）PAM 序列，以及该脱靶位点位于基因间区、外显子或内含子的信息，并分别讨论其潜在生物学影响。
对于所有已确认的脱靶位点，申办方还应综合既有文献、基因功能、表达数据以及疾病相关性信息，对潜在风险进行总结性评估。
G. 其他考虑因素
脱靶编辑活性还可能受到编辑器氨基酸修饰以及递送方式的影响。若对编辑器进行了氨基酸层面的修改以改变其活性或特异性，应详细描述相关修改，并通过内部数据或文献支持其效果。脱靶研究应使用拟用于最终药物产品的编辑器。编辑器表达持续时间对安全性评估亦至关重要，例如，经 LNP 递送的 mRNA 编辑器通常较 AAV 递送的编辑器具有更短的表达时间。对于可能导致长期持续表达的编辑方式，FDA 建议提供额外的长期脱靶风险评估。
VII. 在脱靶编辑位点分析中考虑人类遗传变异的注意事项
个体人类基因组中存在着数百万个核苷酸变异。对于基于CRISPR-Cas的编辑器而言，这些核苷酸变异中的某些变异可能会减少基因组位点与gRNA之间的错配，或者可能会产生一个PAM序列，从而产生一个新的、可能被编辑的基因组位点。同样地，对于其他编辑模式，某个变异可能会减少靶序列与基因组脱靶编辑位点之间的错配，使其更有可能被编辑器的序列识别结构域所识别。无论哪种情况，脱靶编辑风险都将存在于携带该特定变异的个体中。一种充分考虑人类遗传变异、充分的计算机模拟脱靶分析方法，应当能够报告由变异所贡献的潜在脱靶编辑位点。A. 数据库选择
申办方应选择一个或多个人类遗传变异数据库，这些数据库应包含来自健康人群和/或患者人群的变异信息。变异信息应来源于已发表的公开基因组数据库或同等来源。在选择使用一个或多个数据库时，应结合目标人群中的疾病患病率、对常见核苷酸变异的了解以及致病性变异，提供充分的科学依据。
B. 人群分层
如果基因编辑药物产品用于治疗一种流行率已被充分表征的疾病，则申办方可以考虑采用一种计算机模拟脱靶编辑位点提名策略，该策略通过基于特定遗传祖先人群中疾病流行率进行分层后的等位基因频率来选择变异，从而考虑遗传变异性。申办方应提供科学依据，以支持其在分析中使用人群分层策略。
C. 变异等位基因频率
建议在计算机模拟分析中同时纳入基因组中存在的常见变异和罕见变异。申办方可以使用数据库中报告的所有变异，或者提供科学依据，说明选择高于某个频率阈值的变异进行此分析的理由。建议在此分析中纳入所有基因区和基因间区的变异。申办方应提供依据，以支持其在分析中使用变异等位基因频率阈值的策略。
D. 用于识别变异所贡献的脱靶编辑位点的计算机模拟搜索参数
申办方应使用能够识别以下位点的标准：变异通过减少错配和/或降低缺口，增加了gRNA（或靶序列）与基因组位点之间的同源性。对于基于CRISPR-Cas的产品，附加标准应包括识别通过产生PAM序列而增加脱靶编辑潜能的变异。
E. 评估变异所贡献的脱靶编辑位点的编辑潜能
申办方可以进行额外分析，以评估变异所贡献的脱靶编辑位点的编辑潜能。这些分析可包括：使用实验方法测量携带目标变异的样本或基因组样本中的编辑率，或使用计算方法报告作为编辑潜能读出的分数/指标。
F. 报告变异所贡献的脱靶编辑位点
一份详细的、考虑了人类遗传变异的脱靶编辑位点分析报告应包含：对所使用数据库、应用的变异频率阈值以及应用的任何人群分层的详细描述，并附有科学依据；用于识别变异所贡献的脱靶编辑位点的具体标准；此分析的结果应作为变异所贡献的脱靶编辑位点的带注释列表提交。
VIII. 基于 NGS 方法的染色体完整性分析的相关考虑
对于已知会在基因组中产生 DNA 双链断裂和/或导致中至大型插入或缺失的基因组编辑模式，在双链断裂位点发生的错误 DNA 修复过程可能引起染色体易位等结构异常事件，从而影响编辑后细胞的基因组完整性。在上述情形下，FDA 建议申办方采用具有高灵敏度和定量能力的、基于下一代测序（NGS）的方法，对经基因组编辑处理后的细胞开展基因组完整性评估。申办方可考虑采用靶向测序方法、基于引物的测序方法，以及/或者其他基于全基因组范围的 NGS 方法，以检测低频发生的染色体易位事件，并用于定量评估在基因组编辑过程中，于靶向位点发生 DNA 双链断裂后产生的染色体易位发生率。FDA 建议申办方在实施此类分析时，选择具有足够灵敏度、并能够尽量减少技术偏倚的测序策略（参见第 IV 章关于 NGS 的相关考虑）。如果在针对某一药物产品的安全性分析中已确认存在脱靶编辑位点，则申办方还应进一步开展分析，以评估在靶向编辑位点与脱靶编辑位点之间发生染色体易位事件的可能性。请参考以下章节中的相关建议：第 VI.A 节（样本选择的相关考虑）；第 IV 章（测序策略与 NGS 技术考虑）；第 VI.F 节（结果报告中对位点注释的要求）。
IX. 向 FDA 提交脱靶编辑与染色体易位分析研究报告
所有本指南所建议的、用于评估脱靶编辑活性和染色体易位风险的非临床研究，原则上应依据本指南中的建议完成，并在提交原始研究性新药（IND）申请之前完成。申办方应将完整、详细的研究报告随原始 IND 申请一并提交。研究报告应包含本指南所建议的全部信息，并且脱靶编辑和染色体易位分析的结果数据亦应按照本指南中推荐的格式提交。在某些情形下，例如拟定的适应症为超罕见疾病，或治疗对象为单一患者时，考虑人类遗传变异的脱靶分析研究，可能并非原始 IND 提交的必要组成部分。FDA 鼓励申办方在提交 IND 申请之前，与 FDA 就研究方案开展沟通交流。申办方可在这些提交材料中简要说明其脱靶分析计划。可纳入预提交文件中的信息类型概述见下表。
| 申报类型 | 最低限度的信息要求 |
| INTERACT | • 所使用的编辑器（对编辑器所做的任何修饰） • 作用机制（已知信息） • 评估脱靶编辑活性的非临床研究策略（简要描述） - 脱靶编辑位点提名的方法 - 脱靶编辑位点确认的方法 - 染色体易位分析的方法 |
| Pre-IND | • 所使用的编辑器（对编辑器所做的任何修饰） • 作用机制（已知信息） • 评估脱靶编辑活性的非临床研究策略（包括方法、分析参数、用于脱靶位点提名/脱靶位点确认/染色体易位评估或编辑器特异性分析的标准的简要描述） • 已完成评估脱靶编辑风险的研究报告（如有） • 测序策略，包括数据质量、测序深度、比对的详细信息 • 每次分析所使用的样本 |
如果在产品开发过程中，对生产工艺作出重大变更，而该变更可能影响编辑器活性和/或靶向编辑率，从而可能改变药物产品的脱靶编辑谱，则申办方可能需要开展额外的脱靶编辑分析。此外，如果在研究过程中发现新的安全性问题，FDA 亦可能要求申办方提供进一步的脱靶编辑或染色体易位风险评估分析。FDA 鼓励申办方在生产工艺变更或发现潜在安全性问题时，通过正式会议与 FDA 讨论其对脱靶编辑风险的影响评估策略。
在 IND 项下开展的临床研究期间，或在提交 BLA 时，申办方可能需要提交原始测序数据以及用于分析测序数据的相关软件脚本。申办方应在产品开发过程中和/或在提交其 BLA 之前，就此事与 FDA 进行沟通。
撰稿人： Zoey Pang，Grace Tian
