引言
ONTs在非临床安全性评价中存在独特的挑战。尽管现有针对小分子药物和治疗性蛋白质的指南可能提到ONTs，但本指南基于目前针对这一类产品的经验，提供了专门针对ONTs非临床评估的详细建议。这些建议涵盖了ONTs与小分子药物和治疗性蛋白质不同的特性。指南涵盖了包括单链或双链寡核苷酸，这些寡核苷酸可能是合成的或天然衍生的，具有天然或经过修饰的主链或核苷结构，可增加或减少蛋白质的表达和功能，例如反义寡核苷酸、小干扰RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、转运RNA（transfer RNA）、诱饵（decoys）和适配体（aptamers）等寡核苷酸。然而，免疫刺激寡核苷酸，如通过 Toll 样受体起作用的 CpG 基序，以及 CBER 监管的产品，如 DNA/RNA 疫苗、病毒递送的ONTs、信使 RNA 和用于基因编辑的 RNA，不在本指南的涵盖范围内。
1. 一般考量
作用机制（MOA）
ONT（寡核苷酸疗法）通过多种机制实现其预期的药理作用。最常见的是ONT 含有与细胞内核酸的目标序列互补的核苷酸碱基序列。这些互补碱基序列通过沃森-克里克-富兰克林（Watson-Crick-Franklin）碱基配对相互结合（杂交）。这种依赖于碱基序列的杂交随后通过各种下游机制（如反义、沉默）影响特定基因的表达。此外，反义剪接调节ONT还通过与前信使RNA（pre-mRNA）进行沃森-克里克-富兰克林碱基配对来影响成熟mRNA中核苷酸的包含或排除，从而改变编码蛋白的水平或活性。一些ONT（如适配体）则设计成通过与特定蛋白质或其他细胞成分结合来发挥药理作用，这种作用不依赖于杂交，但仍与碱基序列有关。
安全性评价
• 靶点效应 On-target effects（过度药理学效应）
FDA建议评估潜在的过度药理作用引起的不良效应。通常，需要在至少1种种属中使用临床候选药物进行评估，前提是有一种或多种对临床候选分子具有药理响应的动物种属可用。若无响应，可以使用合适的对测试种属有效的替代寡核苷酸进行评估。对于某些无法在毒理学研究中评估过度药理作用的ONT，应提供基于文献的权重证据（Weight-of-Evidence，WoE）评估，以说明由过度药理作用引起的不良效应的潜在可能性。例如以下场景：
1. 目标分子或序列不存在于测试物种的基因组中（例如隐性剪接位点、插入缺失或外源性目标），即无法直接观察药物作用。
2. 目标效应（例如排除特定外显子）导致的转录本与患者群体中的转录本有本质区别（例如，如果外显子排除引起移码，导致生成编码异常氨基酸序列或包含早期终止密码子的转录本）。
• 靶外杂交依赖效应Off-Target Hybridization-Dependent Effects
鉴于ONTs（寡核苷酸药物）能够形成沃森-克里克-富兰克林碱基对，ONTs具有与部分或完全互补的非靶标RNA或DNA序列结合的潜力，从而导致人类的不良反应，而这些反应在毒理学研究中可能无法被检测到。因此，应该使用适当的in silico 和 in vitro方法，对ONTs进行依赖序列的靶外效应评估，以识别潜在的靶外杂交。
• 靶外杂交非依赖效应Off-Target Hybridization-Independent Effects
通过与细胞核酸结合发挥作用的ONTs（寡核苷酸药物）也可能直接与蛋白质或其他细胞成分相互作用。尽管这些相互作用不涉及核酸碱基配对，但这些相互作用仍然可能是依赖序列的。此外，像适配体这样的ONTs，虽然并不设计为直接与其他核酸相互作用，但也可能表现出靶外的非杂交依赖效应。与靶外杂交依赖效应不同，靶外杂交非依赖效应由于寡核苷酸与非核酸靶标相互作用的复杂性，较难预测，因此，预测毒理学方法对于这些效应的适用性较差。所以，对每个新的临床候选ONT进行实证毒性评估是非常重要的。该评估通常遵循国际会议（ICH）发布的《非临床安全性研究指南 M3(R2)：人类临床试验与药品市场批准进行的指导文件》的相关规定，针对小分子药物，进行适当的调整。
2. 药理学
主要药效学和次要药理学
主要药理学研究应考察 ONTs 与其预期治疗靶点的关系及其作用机制，该研究可提供药效作用持续时间和剂量依赖性相关的信息。对于高度特异性的人类靶点，ONTs 可能在动物种属中无药理活性，此时可考虑使用具有活性的替代分子。体外试验可使用人类细胞或表达人类靶点的转基因动物，或敲除目标序列的动物，这些模型也可以提供有关 ONTs 潜在生物学效应的信息。
安全药理学
ONTs的安全药理学评估应关注药物活性物质对重要功能的影响，通常包括心血管、呼吸和中枢神经系统。建议采用药理学相关种属进行评估；如果没有药理学相关种属，FDA 建议仍需对可能的脱靶效应进行评估。安全药理学评估可以在单独的研究中进行，也可以伴随在单次或重复给药毒性试验中进行。
关于安全药理学研究的设计以及推荐评估的终点的进一步指导可以在ICH 7A、S7B和E1中找到。
3. 药代动力学
与其他试验药物一样，FDA 建议对 ONTs 的非临床吸收、分布、代谢和排泄特征进行考察，以支持非临床安全性评价。在启动人体临床试验之前，应在用于重复给药毒性试验的种属中获得系统暴露的数据。ONTs 应采用预期的临床途径给药，如采用不同的给药途径，应提供科学依据。
4. 一般毒性研究
种属选择、研究设计、持续时间（周期）和申报时间
ONTs 的毒性研究通常应在 两个种属中进行：一个啮齿类动物和一个非啮齿类动物，其中至少应有一个种属是药理相关的。如没有药理学相关种属，也建议在两个种属中对临床候选分子进行评估以考察杂交非依赖性脱靶效应。如果使用替代分子，动物研究应包括给与临床候选分子和替代分子的组别。
首次人体试验剂量选择
首次人体试验的剂量应根据 FDA Guidance 《Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers》（2005年7月）的一般原则进行设置。通常，合理的起始剂量推荐采用预期不超过最相关（或更敏感）种属 NOAEL 十分之一的暴露量，通常推荐通过以 BSA 标准化的 HED 进行评估。
5. 遗传毒性研究
仅由天然核酸组成的 ONTs 不需要进行遗传毒性试验。含有非天然核酸、骨架结构或其他结构（如偶联物或连接子）的 ONTs 应评估其遗传毒性潜力。对于那些需要进行遗传毒性试验评估的ONTs，只要能够提供数据支持ONTs被分析细胞摄取，通常认为ICH S2(R1)推荐的测试组合是适当的。文献表明，在细菌突变实验中使用的某些细菌菌株在标准培养条件下不能充分摄取某些ONTs。在Ames实验中使用的细菌菌株未能摄取ONTs的情况下，应考虑使用哺乳动物体外细胞基因突变实验。
6. 生殖和发育毒性研究
ONTs 的生殖和发育毒性评估建议遵循 ICH S5（R3）进行。这种评估依赖于动物研究，这些研究评估对生育力和早期胚胎发育、胚胎胎儿发育（EFD）以及产前和产后发育（PPND）终点的影响。生育力和早期胚胎发育以及PPND研究通常在啮齿动物中进行，而EFD研究则通常使用两种物种，通常是啮齿动物和兔子。在某些情况下，可以使用现有数据的权重证据（例如，作用机制、转基因动物的表型数据、类别效应、一般毒理学研究结果、初步的EFD研究结果、人类遗传数据等) 可以表明ONT对生育或妊娠结果有明显的不良影响。
7. 致癌性研究
申请人应遵循 ICH S1A 确定是否需要开展致癌性研究。对于用于慢性疾病治疗的 ONTs，大多数情况下应进行致癌性评估。对于那些致癌风险类责任数据有限的ONTs（新化学实体）类通常需要在两个物种中进行体内致癌性研究。对于那些已经对致癌风险特征明确的类别的ONTs可以进行单一物种的两年致癌性研究。
8. 局部耐受性
局部耐受性通常可以整合在单次或重复给药毒性试验中进行。对于采用了复杂递送载体的 ONTs，建议在毒性研究中对完整的临床候选药物的制剂处方进行局部毒性考察。
9. 免疫毒性
ONTs 的免疫毒性评估应遵循 ICH 和 FDA 相关指南。某些类型的 ONTs 已知会激活先天免疫系统（如巨噬细胞、组织细胞、补体）。尽管通常无需开展专门的免疫毒性评估，但在一般毒性研究中评估 ONTs 诱导的免疫效应（如细胞因子、补体）可以提供有用的信息。
10. 光安全性
应参考 ICH S10 进行光安全性评价。如果 ONTs 的紫外-可见光吸收仅由天然核酸碱基引起，则无需进行额外的光安全性评价。
11. 其他毒性研究
制剂处方、靶向分子
通常，ONTs 非临床研究应采用与临床试验拟用样品相同的递送用制剂配方和方法。在某些情况下，新型辅料的毒性可以通过单独的辅料研究进行评估。如果 ONTs 与另一种分子（如肽或碳水化合物成分）偶联，则应在非临床研究中采用偶联 ONTs。
杂质/降解产物
ONTs 产品的杂质水平应得到充分控制，并证明不会引起安全问题。ONTs 的杂质可以分为两类：寡核苷酸相关杂质和其他杂质（如有机小分子杂质、残留溶剂、元素杂质）。
幼龄动物研究
对于开发儿科适应症的 ONTs，评估幼龄动物研究的需求时，应遵循 ICH S11。
撰稿人：Emma Xie
